土壌ウイルス補助代謝遺伝子産物の構造特性評価 - 煙台ピークスフィアソリューション株式会社

Nature Communications volume 13、記事番号: 5485 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

メタゲノミクスは、これまで隠されていた土壌ウイルスの世界を明らかにしています。メタゲノム内の多くの土壌ウイルス配列には、ウイルス複製に関連しない推定上の代謝補助遺伝子 (AMG) が含まれています。今回我々は、土壌ウイルス上のAMGが実際に機能的で活性なタンパク質を生成することを証明する。私たちは、一般的な炭素ポリマーであるキチンを代謝するキトサナーゼ酵素をコードする可能性がある AMG に焦点を当てています。私たちは環境メタゲノムから同定されたいくつかのキトサナーゼ遺伝子を発現し、機能的にスクリーニングしています。エンドキトサナーゼ活性を示す 1 つの発現タンパク質 (V-Csn) が結晶化され、超高解像度で構造特性が解析され、土壌ウイルス AMG 産物の構造が表現されます。この構造は活性部位の詳細を提供し、AlphaFold を使用して決定された構造モデルと併せて、基質特異性と酵素機構の理解を容易にします。私たちの発見は、土壌ウイルスが宿主に補助的な機能を提供しているという仮説を裏付けています。

最近のメタゲノム調査により、永久凍土 1、2、解凍された永久凍土 3、草原 4 など、さまざまな土壌生息地にわたって DNA ウイルスの多様性が高いことが明らかになりました。これらのウイルスの大部分はバクテリオファージ 3,4 ですが、いくつかの真核生物ウイルスも検出されています 1,2。土壌生息地におけるこれらのウイルスの機能的役割に関する根本的かつほとんど答えられていない問題があります。土壌バクテリオファージが宿主動態の制御に主要な役割を果たしていることが認識されています5。興味深いことに、土壌ウイルスは、ウイルスの繁殖に直接必要とされない機能をコードする可能性のある遺伝子の発現を通じて、土壌における生物地球化学的プロセスにも直接寄与している可能性があります。非必須のウイルス機能に対応する遺伝子は、補助代謝遺伝子 (AMG) と呼ばれます。 AMG によってコードされる潜在的な機能には、炭素代謝、胞子形成、エネルギー生成が含まれます 6,7。しかし、これまでに発現および機能特性が確認されている土壌ウイルス AMG は 1 つだけであり 3、土壌ウイルス AMG の結晶構造は存在しません。

土壌ウイルスにおける AMG の研究は、土壌生息環境の多様性と複雑さがウイルスの発見を混乱させているため、海洋環境の研究に比べて遅れています。海洋生態系では、光合成タンパク質をコードするウイルス AMG が広く研究されています 8,9。たとえば、一部の海洋ウイルスは psbA 遺伝子を発現し、宿主の感染中に転写産物が増加することが示されています 10、11。タンパク質レベルでは、シアノバクテリアのファージ（シアノファージ）によってコードされるプラストシアニンタンパク質の構造が、シネココッカス属の関連する参照構造に基づいてモデル化されました。 PCC79428。宿主プラストシアニンから同様にモデル化された構造と比較することにより、シアノファージにコードされたプラストシアニンの構造および静電ポテンシャルに対するシアノファージ特異的修飾を予測することが可能でした。さらに、最近、ウイルスのロドプシンの構造が 1.4 Å の分解能で特徴付けられました。この構造により、ウイルスのロドプシンは、藻類の光合成をサポートする役割を担うと予測される独特の光依存性チャネルであることが明らかになりました 12。海洋ウイルスにおけるこれらの最近の発見は、環境中のファージと宿主の適応度を最大化する可能性がある AMG の生態学的重要性を強調しています。

土壌ウイルスで最初に記載された AMG は、さまざまな有機化合物を分解する酵素をコードする遺伝子でした。たとえば、解凍された永久凍土のメタゲノムから 14 個のグリコシド加水分解酵素遺伝子が検出されました。これらの 1 つであるグリコシルヒドロラーゼグループ 5 (GH5) 酵素をコードするウイルス遺伝子は、クローン化され、発現され、機能的なエンドマンナナーゼを表すことが判明しました 3。予測される土壌ウイルス AMG の大部分は、微生物ゲノムデータベース内の注釈付き遺伝子との配列類似性にのみ基づいて潜在的な機能が割り当てられています 4,5。ただし、このアプローチでは、AMG が実際に発現しているかどうか、またタンパク質が機能しているかどうかを判断する能力には限界があります。

AMG は、地球上でセルロースに次いで 2 番目に豊富な炭素ポリマーであるキチン 4,13 の分解に関与する遺伝子をコードする可能性のある土壌ウイルスで発見されています 14。外洋では、ピコシアノバクテリアは主に節足動物によって生成されるキチンを重要な栄養源として利用します15。キチンは真菌の細胞壁や昆虫の外骨格の成分であるため、土壌中に蓄積することもあります。キチン脱アセチラーゼによるキチンポリマーのキトサンへの脱アセチル化に続いて、キトサナーゼはキトサンをさらに分解できる小さなサブユニットに切断し、それによって微生物叢の他のメンバーに炭素源と窒素源を提供します15。キトサナーゼ遺伝子は巨大ウイルスのゲノムに以前から注釈が付けられていました。陸水の緑色微細藻類に感染するクロロウイルス 16 と検出されたウイルス性キトサナーゼは、グリコシルヒドロラーゼグループ 46 (GH46) に属することが特徴付けられました。土壌ウイルス上で運ばれるキトサナーゼ様AMGは主に、これまでGH75真菌キトサナーゼ（pfam07335）として分類されていた別のグループに分類され、エンドスプリット活性でβ-1,4-キトサンを切断する。

今回我々は、土壌ウイルスキトサナーゼAMG産物の機能と構造を特徴づけ、検証します。キトサナーゼが実際に機能することは、遺伝子をクローニングして発現させ、活性アッセイを実施することによって確認されます。我々は、この酵素の超高解像度結晶構造を取得し、キトサナーゼの GH75 ファミリーの潜在的な活性部位の詳細を提供します。

GH75 キトサナーゼ AMG を保有するウイルスコンティグは、Integrated Microbial Genomes and Virome (IMG/VR) データベース (v3.0) から取得されました。合計 142 個の適格な GH75 キトサナーゼ様 AMG が、8 ～ 202 kb の範囲の長さのウイルスコンティグから同定されました。配列の大部分は分類が未分類のバクテリオファージからのものでした。ウイルスコンティグのうち 2 つは、高品質の完全な環状ゲノムでした (補足表 1)。

タンパク質ツリーは、公共のデータベースに保管されている他の微生物のキトサナーゼに対するウイルスのキトサナーゼの関連性を描写するために、配列データから構築されました。ウイルスのキトサナーゼは、古細菌、真菌、細菌の GH75 キトサナーゼとは系統発生的に異なりました (図 1)。 GH75 キトサナーゼは、古細菌キトサナーゼを除き、主に分類学的割り当てに従って別個の分岐群にクラスター化されていました。これは、現在の NCBI データベースに古細菌の代表が欠如しているためである可能性があります。検出されたウイルス性キトサナーゼの大部分は、細菌性キトサナーゼに関連する緊密なクレードを形成しました (図 1)。ウイルスキトサナーゼの系統学的配置は、キトサナーゼがゲノム交換を介して細菌に由来し、遺伝的漂流と多様化の過程でウイルス特異的なバージョンに改変されたことを示唆しています17。この仮説は、GH75 キトサナーゼを含むウイルスコンティグがバクテリオファージとして分類されたという発見によってさらに裏付けられます (補足表 1)。

a ウイルス、真菌 (緑)、細菌 (ピンク)、古細菌 (黒) のキトサナーゼを含む系統樹は、バクテリオファージリゾチーム (YP_006987285.1、赤いノード) によって根づいています。ウイルス性キトサナーゼを表す木の葉は、水生（青）、人工（オレンジ）、陸生（茶色）の生息地によって色分けされています。提案された活性部位の 4 つの重要な残基が色分けされ、最も内側のリングの N 末端位置に最も近い残基を順番に円形リング内に示します。酵素機能の検証のために選択されたウイルスキトサナーゼはアスタリスクで強調表示されます。結晶化に使用されるウイルスキトサナーゼには 2 つのアスタリスクが付いています。 b 4 つの保存部位における各残基の相対頻度を計算し、表に示しました。 c 代表的なキトサナーゼのタンパク質構造は AlphaFold20 によって予測され、系統分類グループに従って色分けされています: 細菌 (ピンク)、真菌 (緑色)、ウイルス (茶色)。

ウイルスキトサナーゼが、細菌および真菌の GH75 キトサナーゼ配列の推定活性部位に存在する 4 つの保存残基を含むかどうかを決定するために、多重配列アラインメントが構築されました 18,19 (補足データ 1)。 GH75 ウイルスキトサナーゼは、配列の一部に置換が含まれていますが、通常、予測される活性部位 (DDDE) の同じ 4 つの重要な残基を保持しています。 GH75 キトサナーゼの大部分は 4 つの位置の最初にアスパラギン酸を持ち、システインまたはアスパラギンに置換されている例もいくつかあります (図 1 の最も内側のリング)。重要な残基の置換が予測される機能に影響を与える可能性があるため、上記の活性部位残基変異体の発生率が集中する傾向があると思われるため、これらのウイルスキトサナーゼをさらにサブグループに分割しました。同定されたウイルスキトサナーゼは、3 つの主要なクレード (図 1 の「クレード 1」、「クレード 2」、「クレード 3」) に分類されました。最初の位置 (「D34」) でのシステイン (相対頻度 14.79%、図 1) とアスパラギン (相対頻度 7.75%、図 1) の置換は、それぞれクレード 1 およびクレード 3 のウイルスキトサナーゼでのみ観察されました。クレード 2 およびグループ 2 のウイルスキトサナーゼには、細菌および真菌のキトサナーゼの大部分と同じ残基が含まれていました。システイン置換の有無にかかわらずクレード 1 のウイルスキトサナーゼをそれぞれグループ 1.1 およびグループ 1.2 と名付け、アスパラギン置換のあるクレード 3 およびアスパラギン置換のないクレード 3 のウイルスキトサナーゼをそれぞれグループ 3.1 およびグループ 3.2 と名付けました。一部のウイルスキトサナーゼはサンプルの起源に従ってグループ化されており、土壌ウイルスは水生ウイルスとは別にグループ化されています。土壌特異的配列は主にグループ 1.2 とクレード 3 にありました。

最近導入された人工知能ベースのタンパク質構造予測ソフトウェア AlphaFold20 を使用して、構造予測のためにさまざまなクレードの代表者 (図 1) が選択されました。以前に報告され、文献で特徴付けられていたいくつかの細菌および真菌の GH75 キトサナーゼの構造も予測されました。すべての GH75 メンバーに共有される 2 つの特徴的な配列領域は、他のファミリー、たとえば GH45 に見られるグリコシルヒドロラーゼドメインのフォールドを形成しました。これらの共有領域は、特徴付けられていないドメイン、つまりさまざまな長さの異なる挿入を含む可変領域を囲みます（補足図1）。ウイルス AMG 産物のいくつかの予測された構造では、この挿入は、構造全体の中央にある顕著な裂け目の片側を形成する約 70 アミノ酸の特徴づけられていないドメインとして折り畳まれます。 GH75 の一部の細菌メンバーには相同挿入が含まれているようです (補足図 1)。他のウイルスのキトサナーゼ様 AMG 配列、および予測される細菌および真菌の配列のすべてには、この長い挿入が欠けており、実質的なドメインを形成していないようです。これらの配列に配列の非相同領域がある限り、これらの構造予測は、異なるグループの比較分析に役立つ可能性があります。

142 個の GH75 キトサナーゼ様 AMG のうち 10 個の DNA コード配列は、大腸菌での組換え発現のためにコドン最適化されました (選択された配列は図 1 に星印で示されています)。 10 種類のタンパク質のうち 9 種類で発現が観察されましたが、最初のターゲットの 2 つを除くすべてで、タンパク質は主に不溶性画分で観察されました。他の 2 つのターゲットについては、エンドキトサナーゼ活性をアッセイするのに十分なタンパク質が発現および精製されました。以下、V-Csn (ウイルスキトサナーゼの略) と呼ぶ発現タンパク質の 1 つだけが活性を示し、この活性は pH 5 付近で最大でした (図 2a)。対応する配列はグループ 3.1 に由来し、図 1 では 2 つの星印で示されており、予測される DDDE 活性部位残基が示されています。この特定の配列は森林土壌メタゲノムに由来します (補足表 1)。 V-Csn を運ぶウイルスは、プロテオバクテリアファージであると予測されました (補足表 1)。 V-Csn に対するエンドキトサナーゼ活性は、キトサナーゼ活性部位の一部であると考えられる位置での 2 つの単一残基置換によってさらに裏付けられました。 Aspergillus umigatus 21 および Fusarium solani 19 の真菌 GH75 キトサナーゼに関する生化学的、速度論的、および突然変異の研究に基づいて、2 つの残基 (A. fumigatus の D160 と E169、および F. solani の D175 と E188) が必須の触媒であると以前に仮定されていました。残留物。 Streptomyces avermitilis 由来の細菌 GH75 キトサナーゼの配列分析により、これらの残基がこの酵素にも保存されていることが示されました 18。 V-Csn、A. fumigatus、F. solani、および S. avermitilis 配列の部分アラインメントに基づくと (図 2b)、V-Csn の対応する残基は D148 および E157 です。 D148N 置換または E157Q 置換のいずれかを含む 2 つの V-Csn 構築物を生成し、それぞれの変異酵素の活性を測定しました。活性は、D148N では 5 分の 1 に減少し、E157Q ではほぼ除去されました (図 2c)。両方の構築物は、天然の V-Csn と同一のゲル濾過クロマトグラフィー保持時間で溶出し、円二色性スペクトルは、両方の構築物が折りたたまれていることを示しました。続いて、V-Csn と 2 つの変異酵素の結晶化試験が行われました。

V-Csn の活性は、不溶性アズリン架橋キトサン基質 (AZCL-キトサン) から可溶性アズリン-糖フラグメントとして放出された後、590 nm でのアズリン吸光度をモニタリングすることによってアッセイされました。反応は酢酸緩衝液中、室温で一定範囲の pH 値にわたって実行されました。データは、反復実験 (n = 3) の平均を表し、標準偏差はエラーバーで示されています。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。 b Aspergillus umigatus、Fusarium solani、および Streptomyces avermitilis 由来の 3 つのキトサナーゼ酵素による V-Csn の部分配列アラインメント。 V-Csn の二次構造はアラインメントの上に示されています。触媒作用に関与する可能性がある 4 つの保存された酸性残基は青と赤に色付けされています。 GH75 ファミリー酵素の利用可能な配列をアラインメントすると、アラインメントの下の星印で示されるように、4 つの酸性残基と 2 つのグリシン残基の 6 つの位置のみが普遍的に保存されていることがわかります。 c pH 5.1の酢酸緩衝液中での、野生型V-CsnおよびD148NまたはE157Q置換のいずれかを含む2つの構築物によるアズリンの放出。データは、反復実験 (n = 3) の平均を表し、標準偏差はエラーバーで示されています。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。 d 薄緑色 (ドメイン 1) とピンク色 (ドメイン 2) の 2 つの構造ドメインを持つ V-Csn 酵素の apo1 型のリボン表示。二次構造の命名法が、N 末端および C 末端の位置とともに示されています。 e V-Csn apo1 (分子 1、黄色のリボン) と結晶学的対称パートナー (分子 2、青色のリボン) から構築された二量体、および V-Csn apo2 ホモ二量体 (灰色のリボン) の重ね合わせ。二量体界面を構成する二次構造要素が示されています。プライムが付いた二次構造要素は、対称性関連の apo1 分子を表します。 f 分子 1 を黄色の分子表面、分子 2 を青いリボンとして示す V-Csn apo2 二量体。 2 つの分子間の接触領域は、黄色の分子 1 の表面に水色で表示されます。ソースデータはソースデータファイルとして利用できます。

V-Csn 構造は 2 つの結晶形で解析されました。 apo1 は非対称単位に単一の分子を含み、apo2 は非対称単位に二量体を含みます。 apo1 構造は、apo1 型の結晶に浸み込んだ臭化物イオンからのシグナルを使用する単一異常回折 (SAD) 法によって解明されました。この構造は phenix.autobuild22 を使用して自動的に構築され、COOT (v0.9.8.2)23 で完成しました。臭化物の異常信号は約 1.5 Å の分解能まで拡張され、構造は最初にこのデータに精密化されました。精密化は、分解能 0.89 Å に及ぶ高分解能 apo1 データセットに対して phenix.refine24 を使用して完了しました。最終モデルは、一本鎖に 1811 個のタンパク質原子、398 個の水分子、3 個のグリセロール、および 1 個の硫酸アニオンで構成されていました。最終的な Rwork と Rfree は、合計 174,427 回の反射に対して 0.1198 と 0.1307 でした。 apo2 結晶形は、精密化された apo1 構造を検索モデルとして使用し、分子置換によって解決され、phenix.refine で精密化されました。

単一の V-Csn 分子が apo1 非対称ユニットに位置しました。この構造は、2 つの隣接しない構造ドメインから構成されていました (図 2d)。ドメイン 1 の N 末端部分 (残基 1 ～ 36) が最初に折りたたまれ、次にポリペプチドはドメイン 2 全体 (残基 37 ～ 108) を折りたたんでから、完全なドメイン 1 (残基 109 ～ 224) に戻ります。精製の初期段階で、少なくとも 3 つの追加残基に相当する残留密度が N 末端で観察されました。発現ベクターの配列を検査したところ、リンカーの 3 つの残基 (G、H、および S) が N 末端メチオニンに結合しており、これらの残基がモデルに追加されたことが示唆されました。 apo2構造には、非対称ユニット内に2つの独立したV-Csn分子があり、2つの分子は非結晶学的二量体を形成します（図2e）。 apo2 ダイマーの 2 つの分子を apo1 構造に重ね合わせると、両方の分子の二乗平均平方根偏差 (RMSD) が 0.45 Å になります。 apo1 結晶形では、C2 空間群の結晶学的対称性によって生成されるにもかかわらず、同じ二量体が観察されます（図 2e）。これは、酵素活性に二量体化が必要であるという証拠はないが、サイズ排除クロマトグラフィーに基づいて、V-Csn が溶液中で二量体として存在するという観察と一致しています。ダイマーの形成により、モノマーあたり 1830 Å2 (約 9%) の表面が埋められます。接触領域には、1つの分子のβ鎖β4とβ5（ドメイン2内）間のループが含まれており、2番目の分子のヘリックスα3とα4の間にスロットがあり（図2f）、水素結合と、ドメインからの残基との疎水性相互作用を介して結合されています。 2つのヘリックスと鎖β8。

ドメイン-1は、ストランドβ1、β2、β3、β7、β8、およびβ10で構成される中央の6本のストランド逆平行ねじれβシートで構成されています（図3a、b）。 2 本の短いストランド (β6 と β9) が中央の β シートの凹面に集まり、2 つのヘリックス (α4 と α5) がシートの凸面を横切って巻き付いています。単離されたドメイン 1 を使用した Dali 検索 25 では、Z スコアが 5 を超える 1,000 件を超えるヒットが得られます。上位ヒットの最初の分析では、ドメイン 1 が、共通のコアドメインを持つ多様なタンパク質と構造的類似性を持っていることが示されています。 β3、β6、β7、β8、β9およびβ10鎖からなるダブルpsiβバレル（DPBB）を含む。これらのタンパク質には、植物防御タンパク質のキウェリン 26、27、バーウィン 28、カーウィン 29、真菌の植物毒セラトプラタニン 30、ストレプトマイセスのパパイン阻害剤 (SPI)31、エクスパンシン (植物の細胞壁を緩めるタンパク質) のドメイン 132、33、ヒトASPL34 のユビキチン調節ドメイン、および炭水化物加水分解エンドグルカナーゼ 35、36、37。 Barwin、carwin、およびエンドグルカナーゼは、グリコシルヒドロラーゼ GH45 ファミリー (https://pfam.xfam.org/family/PF02015) のメンバーとして分類されており、V-Csn との比較により、GH45 酵素と GH75 酵素の両方が強力な耐性を持っていることが示されています。構造的な類似性。しかし、どちらのファミリーも GH46 酵素と構造的類似性はなく、そのほとんどはキトサナーゼとして注釈が付けられていますが、T4 リゾチームを彷彿とさせる 2 ドメインのα-ヘリックス構造を持っています 38。

apo1 構造のドメイン 1 は、ダブル psi β バレル (DPBB) 構造モチーフを見下ろすように配向されています。 DPBB を構成するストランドは明るい緑色で強調表示されます。 b DPBB モチーフの折り畳みを強調したドメイン 1 のトポロジー図 (明るい緑色)。 c V-Csn apo1 構造の 2 つの psi モチーフ (緑色とシアン)。構造的類似性が明らかなように、ほぼ同じ向きで示されています。 d V-Csn apo1 構造に関連する 2 つの psi モチーフ。緑色の psi モチーフは c とほぼ同じ方向にあり、シアンの psi モチーフは軸を中心に約 180 度回転してページ内に入ります。これらは一緒になって、ダブル psi β バレル (DPBB) 構造モチーフを構成します。 e V-Csn ドメイン-1 (薄緑色) と Actinidia chinensis 由来のキウェリン (PDB コード 4PMK; オレンジ色のリボン) の重ね合わせ。 kiwellin の Loop1 と Loop2 は、V-Csn の Domain-2 (ピンクのリボン) の一部とほぼ一致します。 f V-Csn ドメイン-1 (薄緑色) と Humicola insolens 由来のエンドグルカナーゼ V の重ね合わせ (PDB コード 4ENG; 黄色のリボン)。エンドグルカナーゼ V のループ 1 および 2 は、V-Csn のドメイン 2 (ピンクのリボン) にほぼ対応します。 g V-Csn ドメイン-1 (薄緑色) と Clavibacter michiganensis 由来のエクスパンシン (PDB コード 4JCW; 薄紫のリボン) の重ね合わせ。エクスパンシンのループ 1 は V-Csn ドメイン 2 (ピンクのリボン) の一部に対応しますが、エクスパンシンの C 末端ドメイン (C ドメイン) は V-Csn と構造的類似性を持ちません。

2 つの連動する psi モチーフを含む DPBB ドメインは、アスパラギン酸-α-デカルボキシラーゼ、エンドグルカナーゼ V、DMSO レダクターゼ、および barwin39 について最初に記載されました。 V-Csnでは、各プサイモチーフは2本の長い逆平行鎖で構成されており、1本はN末端半分がC末端半分とほぼ直交するようにほぼ90°曲がっており、1本の短い鎖はC末端と平行に走っている。長いストランドの一部（図3c）。 2 つの psi モチーフ (psi1; β3、β9 および β10、および psi2; β6、β7 および β8) は、2 つの短い鎖 (β6 および β9) が擬似二重軸を持つ逆平行ペアを形成するように、互いに対して配向されています。それらの間で psi1 を psi2 にマッピングします (図 3d)。ダリのDPBBを含むトップヒットのいくつかを重ね合わせると、これらの無関係なタンパク質における2つのプサイモチーフの保存されたトポロジーが示されます（図3e-g）。いくつかのループ伸長がこれらのタンパク質の DPBB ドメインを修飾しています。 V-Csn 鎖の番号付けに関して、これらは次のとおりです: (i) psi1 モチーフの鎖 β3 と psi2 モチーフの鎖 β6 の間のループ 1、(ii) psi2 の β8 と psi1 の β9 の間のループ 2、および (iii) psi1 モチーフの鎖 β6 と β10 の間のループ 3。 V-Csn では、ループ 1 の拡張部分がドメイン 2 のすべてをカプセル化しますが、他のタンパク質では、このループの長さと構造は異なります (図 3e-g)。

V-Csn ドメイン 2 は、二次構造が明らかに欠如しているという点で非常に珍しく、一見すると本質的に構造化されていないように見えます (図 2d)。ドメイン 2 の phi/psi 角度のラマチャンドランプロット分析 (図 4a) は、よく折りたたまれたタンパク質で予想されるように、主鎖のねじれ角度が優先される α および β 領域にクラスター化していることを示しています。しかし、典型的なタンパク質構造とは異なり、ドメイン 2 には、長く連続したα-ヘリックス構造またはβ-ストランド構造が欠けているようです。 DSSP (PROCHECK および PyMOL で実装) および STRIDE サーバー 40 を含む複数のアルゴリズムを使用した二次構造特性の計算では、すべて 2 つのシングルターン 310 ヘリックス (α1 および α2) と 2 つの短い鎖 (β4 および β5)、および 4 つの個別の残基が特定されます。 β-ブリッジ (残基 G56、W63、V68 および P74) として注釈が付けられています。 2本の短いβ鎖は互いに逆平行に走り、3つの水素結合を介して接続されています（図4b）。 4 つの β ブリッジ残基は、ヘリックス α1 とストランド β4 の間のポリペプチド片に局在し、2 つのヘアピンターンに折り畳まれ、これらの β ブリッジ残基の主鎖原子間の水素結合相互作用によって、いくつかの側鎖とともに保持されます。主鎖の水素結合。 (図4c)。結晶構造が完成した後に行われた V-Csn の AlphaFold 予測は、特徴付けられていないドメイン 2 (67 個の一致する Cα 原子に対して 0.8 Å RMSD) を含む配列全体にわたって著しく近かった (222 個の一致する Cα 原子に対して 0.6 Å RMSD)。 ) (図4d)。

V-Csn apo1 のドメイン 2 のラマチャンドランプロット。主鎖のねじれ角 (ファイとプサイ) は、水色の三角形 (グリシン)、水色の四角形 (プロリン)、および青い円 (他のすべての残基) として示されています。 β シート、α ヘリックス、および左巻きヘリックスの 3 つの優先領域はピンク色で表示されます。追加的に許可された領域は淡黄色で表示されます。 b ドメイン 2 の 2 つの短い β 鎖、β4 と β5 の間の水素結合相互作用。 c ヘリックスα1（310ヘリックス）と鎖β5の間のドメイン2の20残基領域における水素結合相互作用（主鎖原子のみを灰色の棒として示す）。この領域には、β ブリッジとして指定される 4 つの残基、G56、W63、V68、および P74 (マゼンタ色) が含まれています。これらの残基は、他のβブリッジ残基およびそれらに隣接する残基との主鎖-主鎖水素結合に関与しています。 20 残基の領域は 2 つのヘアピンループに折りたたまれており、各ループ内の酸性残基 (D57 および D69) が主鎖アミド窒素原子との水素結合相互作用を通じて各ヘアピンを安定化します。 d 予測された AlphaFold V-Csn 構造 (灰色のリボン) と V-Csn apo1 結晶構造 (それぞれドメイン 1 とドメイン 2 を表す緑とピンクのリボン) の重ね合わせ。

apo1 構造を検査すると、推定活性部位残基として同定された 2 つの残基 (D148 および E157) が 2 つの構造ドメイン間の裂け目に位置していることがわかります (図 5a)。 2つの追加の酸性残基（D34およびD36）もD148に隣接するこの裂け目に位置しており、これらの残基は他のGH75キトサナーゼでも保存されていました（図2b）。 V-Csnでは、D148の側鎖は、A92の主鎖アミド窒素およびD34およびD36の両方の側鎖と水素結合相互作用を形成します（図5b）。このような酸性残基のクラスター化は珍しいことですが、前例のないことではなく、酸性側鎖が金属結合における役割によって互いに接近している金属タンパク質、またはプロトンを共有している酵素活性部位のいずれかで発生します。結晶化のpH（4.6）では、これらの酸性残基のほとんどがプロトン化され、したがって本質的に中性であることが予想され、このpHでの活性部位の裂け目内の静電表面の計算では、負の電荷はほとんど示されません（図5c））。しかし、酵素の至適pH（5.1〜5.5）では、アスパラギン酸残基のプロトン化がやや低くなり、裂け目にはかなりの負電荷が存在します（図5d）。これはキトサン基質をポケットに引き付けるのに重要である可能性があります。。

ドメイン間の裂け目にクラスター化した4つの保存された酸性残基（黄色と赤色の棒）を有するV-Csn apo1構造の溶媒アクセス可能な表面表現。図 2d と同様に色付けされた表面: ドメイン 1、緑色。ドメイン 2、ピンク。 b 4 つの保存された酸性残基を強調する推定活性部位の拡大図。水素結合は黒い破線で示され、水分子は赤い球で示されます。 c pH 4.6で計算されたV-Csn apo1の静電表面。表面は、-5 kT/e (赤) から +5 kT/e (青) までの輪郭が描かれています。 d pH 5.5で計算されたV-Csn apo1の静電表面。表面は、-5 kT/e (赤) から +5 kT/e (青) までの輪郭が描かれています。 e キトヘキサオース-V-Csn複合体の溶媒アクセス可能な表面表現。活性部位裂における三糖部分（黄色、青色、赤色のCPK球）の位置を示します。上面図の分子の方向は a とほぼ同じで、下面図は側面図を示すために 90°回転しています。酵素は構造ドメインごとに色分けされています (ドメイン 1、緑色、ドメイン 2、ピンク)。 f 2.5 σで等高線化された結合基質の残留Fo-Fc電子密度(ピンク色のメッシュ)。電子密度マップは、分子置換後、基質の組み込み前に計算されました。最終的に精製された三糖分子 (GlcN-1、GlcN-2、および GlcN-3) はシアン色の棒で示されています。 g 活性部位に三糖類 (シアン色の棒) が結合したキトヘキサオース - V-Csn 複合体のリボン表示。水素結合は黒い破線で示され、水分子は小さな赤い球体で示されます (ドメイン 1、緑、ドメイン 2、ピンク)。 h Humicola isolens エンドグルカナーゼ V (Cel45) のセロヘキサオース複合体の溶媒アクセス可能な表面表現: DPBB ドメイン、黄色。小さなサブドメインの 2 つのループ、茶色 (下) とオレンジ (上)。セロヘキサオース分子 (マゼンタ) は、DPBB ドメインと 2 つのループの間の狭いトンネルで結合しています。パネルの右側の図は、V-Csn の開いた活性サイトとは対照的に、トンネル状の活性サイトを示すために 90 度回転されています。 i Cryptopygus antarcticus エンドグルカナーゼ CaCel の溶媒アクセス可能な表面表現: DPBB ドメイン、水色。 2 つのループは青 (下) とシアン (上) に色付けされています。 hのCel45複合体に由来するセロヘキサオース分子（マゼンタの棒）によって示される、基質結合亀裂とトンネルの位置。

部位特異的変異体 D148 および E157 を構築しました。どちらの場合も、カルボキシレートが対応するアミドに変換され、変異タンパク質 D148N および E157Q が生成されました。 2 つの変異体 V-Csn タンパク質は野生型タンパク質と同じ条件下で結晶化され、高分解能での分子置換によって構造が決定されました。野生型 apo1 構造上に 2 つの変異体構造を重ね合わせると、すべての Cα 位置でそれぞれ 0.11 Å および 0.07 Å の RMSD が得られ、変異体と野生型構造間の立体構造の違いがほとんどないことが示唆されました。両方の変異体タンパク質をキトヘキサオース（6つのD-グルコサミン（GlcN）残基のβ-（1-4）結合ポリマー）と共結晶化すると、E157Q変異体のみとの複合体が得られた。基質はドメイン間の裂け目に位置し（図5e）、6つのGlcN残基のうち3つ（以下、GlcN-1、GlcN-2、およびGlcN-3と名付けます）がFo-Fc電子密度で可視（図5f）、配向されていました。 GlcN-1 が還元末端であるようにします。 GlcN-2 および GlcN-3 残基は標準的ないす型構造ですが、最初に観察された残基 (GlcN-1) の密度は歪んだ舟形構造を示唆しています。

GlcN-1残基は、O6原子とQ157の側鎖の間の単一の水素結合によって固定されています（図5f）。中央の GlcN 残基 (GlcN-2) は、ドメイン 2 の A90 の主鎖カルボニル酸素への 3 番目のアミンを介して、その遊離アミンを介して D148 および D36 の側鎖と水素結合相互作用します。 GlcN-3 残基は、O6 原子を介して T91 のカルボニル酸素と水素結合相互作用を起こし、もう 1 つは水分子と水素結合相互作用します。 GlcN-3 の非還元末端 (O4 原子) では追加の Fo-Fc 密度が観察されましたが、密度がまばらなので 4 番目の GlcN をモデル化することはできませんでした。三糖フラグメントの位置とそれがタンパク質と行う相互作用は、残基 D36 と D148 が -2 サブサイト 42 を形成し、基質の結合と配向に重要な役割を果たしている（この場合は GlcN-2 残基を介して）ことを示唆しています。 E157 残基は -1 サブサイトを表し、加水分解が GlcN-1 の還元末端で起こったと仮定すると、結合切断の原因となる求核基として機能する可能性があります。

V-Csn ドメイン 2 の機能は完全には理解されていませんが、いくつかの証拠は、V-Csn ドメイン 2 が活性部位の形成および基質結合に関与していることを示しています。 V-Csn 構造と、Humicola insolens 由来の GH45 ファミリー酵素エンドグルカナーゼ V (Cel45) (PDB コード 3ENG)35,36 および Cryptopygus antarcticus 由来のエンド-β-1,4-グルカナーゼ (CaCel45) (PDB コード 5H4U) の構造との比較)37 は、これらのグリコシルヒドロラーゼの活性部位の裂け目は、一方の側では DPBB ドメインと触媒的に重要な酸性残基を運ぶループによって構成され、もう一方の側ではループ-1 (GH45 酵素の長い蛇行ループ) によって構成されていることを示しています。 V-Csnのドメイン2全体と同等）およびループ-3（GH45酵素の3つのヘリックスバンドル）（図3e、5h、i）。 Cel45 のセロヘキソース複合体 (PDB コード 4ENG) の個々のサブサイトの分析では、-1 および +2 サブサイトの両方がそれぞれループ 1 およびループ 3 の残基によって部分的に形成されており、+1/-1 切断部位に隣接するこれらのサブサイトは、加水分解前のセルロース基材の正しい配向にとって重要です。実際、Cel45とCaCel45の両方で、活性部位の裂け目の壁がトンネルを形成し、そこをセルロース基板が通り抜けます（図5h、i）。

前述したように、V-Csnドメイン-2（残基Ala90およびThr91）のループは-2および-3サブサイトの形成に関与しており（図5g）、キトサン基質のこの端を正しく配向すると予想されます。 -1/+1 切断部位の最適な位置。さらに、セロヘキソアーゼ-Cel45複合体をキトトリオース-V-Csn複合体上に重ね合わせ、V-Csn活性部位裂け目へのセロヘキソース部分をモデル化すると（図6a、b）、ドメイン2の残基Asp50およびAsn54が、 +1 サブサイトは基質のこの端を効果的に固定しており、+2 および +3 サブサイトはドメイン 1 に限定されている可能性が最も高くなります。酵素機能の検証のために選ばれた9種類のウイルスキトサナーゼのAlphaFold予測モデル（図1）をV-Csnに重ね合わせると、それらはすべてV-CsnのAsp50と空間的に同等のアスパラギン酸塩を持ち、9つのうち4つはいずれかのアスパラギン酸塩を持っていることがわかります。 Asn54 と同等の場所にある Asn または Asp。 V-Csnのドメイン1とドメイン2の間に形成された裂け目（図5e）は、GH45酵素のトンネルよりも広いですが、V-CsnとGH45酵素の構造的類似性は、ドメイン2が鍵であることを示していますV-Csn におけるキトサン基質の認識、結合、最適な配向における役割。

a キトヘキサオース-Cel45複合体（PDBコード4ENG）の重ね合わせに基づいて活性部位裂け目にモデル化されたセロヘキサオース（マゼンタの棒）を含むE157Q-V-Csn変異体（緑およびピンクのドメイン）の分子表面表現。 E157Q-VCsn複合体で観察される3つのGlcN残基は、シアン色の棒として示されている。 b キトヘキサオース-Cel45複合体の重ね合わせに基づく、V-Csnの推定GlcN+1認識部位。 c DPBBドメインを含むいくつかの酵素によるV-Csnの部分構造ベースの配列アラインメント。アラインメントは、DPBB モチーフに基づいて、V-Csn に対する酵素の重ね合わせから決定されました。 V-Csn 活性部位で観察される 4 つの保存された酸性残基は、青と赤で色付けされています。 GH45 酵素および他の DPBB 含有タンパク質の一致する残基は、構造的に同等である場合、同様に色付けされます。使用した配列は次のとおりです。Cel45、Humicola isolens 由来のエンドグルカナーゼ V (Genbank P43316.1)。 CaCel、Cryptopygus antarcticus 由来のエンドグルカナーゼ (Genbank ACV50415.1)。 MaEG、Melanocarpus albomyces 由来のエンドグルカナーゼ (Genbank CAD56665.1)。 TtCel45A、チエラビア・テレストリス由来のエンドグルカナーゼ（Genbank 1182607135）。 EXLX1、Bacillus subtilis 由来のエクスパンシン (Genbank O34918)。 SPI、Streptomyces mobaraensis 由来の Steptomyces パパイン阻害剤 (Genbank WP_004951535.1)。 Carica papaya の carwin (Genbank 4JP6_A); Actinidia chinenesis のキウェリン (Genbank AGC39168.1)。 d V-Csn (緑とピンクのリボン、緑とピンクのスティック、黒の太字ラベル)、Cel45 (黄色のリボン、細い黄色のスティック、オレンジ色の斜体ラベル、PDB コード 3ENG)、および Expansin EXLX1 (水色のリボン、水色のスティック) の重ね合わせおよびシアンの斜体のラベル、PDB コード 4FFT)。 DPBB モチーフを一致させることによって構造を重ね合わせました。 e V-Csnによって触媒される提案されたグリコシド結合切断反応の概略図。 Glu157 は触媒プロトン供与体として機能し、Asp36 は水分子からプロトンを受け取る触媒塩基として機能します。

前述したように、いくつかの既知の GH75 キトサナーゼに関する生化学的および酵素学的研究では、2 つの酸性残基 (V-Csn の D148 および E157 に相当) が触媒作用に決定的に関与していることが示唆されました 18、19、21。 GH75 酵素は、アノマー炭素の立体化学を反転させてオリゴ糖生成物の α アノマーを生成するエンドグルカナーゼ 18 であることが確立されており 19,21、そのため、V-Csn も反転酵素である可能性があります。炭水化物結合酵素および/または加水分解酵素として注釈が付けられているDPBB酵素では、V-Csnの重ね合わせに基づいて、V-CsnのE157に相当する位置の酸性残基が普遍的に保存されている（グルタミン酸またはアスパラギン酸のいずれか）ことは注目に値します。これらのDPBBとそれに続く構造ベースの部分配列アラインメントの生成を使用します（図6c）。 Cel4535,36 および CaCel4537 の構造データは、この酸性残基が GH45 酵素の触媒プロトン供与体であることを示唆しており、GH45 および GH75 酵素の DPBB ドメインの構造類似性を考慮すると、E157 が触媒プロトン供与体である可能性が非常に高いです。 V-CSNで。 GH45 酵素は、切断されたグリコシド結合のアノマー炭素における配置の反転を引き起こすエンドグルカナーゼとして分類されることに注意する必要があります 43。

触媒塩基の正体はそれほど明らかではありませんが、同じ重ね合わせと配列アラインメントに基づくと（図6c）、Cel45とCaCelはそれぞれの酵素のN末端近くに酸性残基（Cel45ではD10、CaCelではD13）を持っています。 β(1,4) グリコシド結合の加水分解中にプロトンを受け取る一般的な塩基として特定されています 35,37。これらの残基は構造的にV-CsnのD36と同等であり（図6d）、これはこの残基がウイルス酵素においても触媒塩基として作用している可能性があることを示唆している。 V-Csnの推定反応機構の概略図を図6eに示します。前述したように、真菌および細菌の GH75 酵素は、これと同じ位置にアスパラギン酸残基を持っています (図 2b)。逆に、糖質結合酵素および/または加水分解酵素として暫定的に注釈が付けられている他のDPBB酵素は、Streptomycesパパイン阻害タンパク質（PDBコード5NTB）31およびキウェリン（PDBコード4PMK）を除き、D34またはD36に相当する酸性残基を欠いています（図6c）。 )26、それでもそれらは D148 と構造的に同等のアスパラギン酸塩を持っており、これがこれらの酵素の触媒塩基として作用している可能性があります。 V-Csn 活性部位の 4 つの酸性残基のそれぞれの機能はまだ完全には理解されていませんが、クレフト内でのそれらのクラスター化、および GH45 および GH75 酵素からの裏付け証拠は、それらが役割を持っている可能性が高いことを示唆しています。基質結合 (D34 および D148) および触媒機構 (D36 および D157) において。機能の割り当ての検証は、さらなる変異および基質結合の研究を待たなければなりません。

要約すると、この研究にはいくつかの生態学的意味があります。我々は、厳格なスクリーニング基準と上流/下流のコード領域の検査を適用することにより、土壌ウイルス配列から推定上のAMGを同定し、土壌ウイルスに含まれる少なくとも一部のAMGが機能的であることを最終的に実証した。私たちの厳密な分析により、土壌ウイルス AMG 産物の結晶構造が判明しただけでなく、グリコシルヒドロラーゼの GH75 ファミリーにおける、これまで特徴づけられていなかったこのキトサナーゼ酵素の作用機序を提案することもできました。含まれて比較されたキトサナーゼ配列により、ウイルスのキトサナーゼと、細菌および真菌で以前に報告されているキトサナーゼとの間の系統学的区別が明らかになった。しかし、ウイルスのキトサナーゼは細菌クレード内のサブグループであり、キトサナーゼ AMG で検出されたウイルスはバクテリオファージであったため、これはそれらが細菌に由来することを示唆しています。土壌ウイルスのキトサナーゼも、水生系の対応するキトサナーゼとは異なるサブグループを形成しました。私たちが機能的および構造的に特徴付けた V-Csn 酵素は、森林土壌の配列に由来します (DOI 10.46936/10.25585/60000627、補足表 1)。森林土壌は、他の土壌タイプよりも菌類が多いという特徴があることがよくあります44。これは、真菌の細胞壁の主要成分であり、炭素と窒素の両方の重要な供給源であるキチンの分解を助ける能力を持つウイルスを選択する理由である可能性があります。宿主とは独立してこの能力をもつウイルスが選択された理由は、現時点では不明です。ウイルスがそれぞれの宿主での光合成によるエネルギー生成をサポートする AMG を運ぶ海洋システムと同様に、土壌ウイルスも、土壌中で利用可能な炭素資源が利用可能になると、宿主がそれらを分解するのに役立つ可能性があります。

統合微生物ゲノムおよびバイローム (IMG/VR) データベース (v3.0)46 は、予測されたキトサナーゼ遺伝子に対応する配列についてスクリーニングされました。キトサナーゼ HMM (pfam07335) によって注釈が付けられた遺伝子を持つウイルスコンティグは、JGI ウイルス検出パイプラインを適用することによって最初に同定されました 47。より保存的な機能割り当てのために、ウイルスキトサナーゼ配列は、hmmsearch (Hmmer v3.1b2) を使用して、EggNOG48、炭水化物活性酵素データベース (CAZY)49、およびメタゲノムデータベースの機能オントロジー割り当て (FOAM)50 を含むアノテーションデータベースに対してさらにチェックされました。 51、blastp (v2.9.0+)52 を使用して NCBI キトサナーゼとの配列類似性を検索します。次に、推定上のウイルスキトサナーゼをリゾチーム HMM のプロファイルに対してスクリーニングして、誤って注釈が付けられたリゾチーム (PF13702、PF00959、PF04965、PF18013、PF00062、および NCBI ウイルスに寄託されたリゾチーム配列を使用した自己キュレートされたリゾチーム HMM4) を除去しました (11 月 16 日にアクセス) 2020年）。

キトサナーゼ遺伝子をウイルス AMG として確実に割り当てるために、上記の手順でスクリーニングされたキトサナーゼ遺伝子を保持するウイルスコンティグのゲノム内容を検査しました。ウイルスコンティグの遺伝子は、Prodigal (v2.6.3)53 を使用して予測および翻訳されました。タンパク質配列には、checkV (v0.7.0) に実装されている 7185 個の微生物特異的 HMM と 8773 個のウイルス特異的 HMM に加えて、EggNOG 細菌および古細菌データベース、および 3 つのウイルスデータベース 4,54 によって注釈が付けられました。キトサナーゼ AMG 候補は、ウイルスコンティグ上の遺伝子の位置とウイルスの特徴遺伝子の有無に応じて 5 つのカテゴリーに分類されました4。カテゴリー 1、上流と下流の両方のウイルス特異的遺伝子、および上流または下流のいずれかのウイルスの特徴的な遺伝子。カテゴリー 2、上流と下流の両方にウイルス特異的遺伝子があるが、ウイルスの特徴的な遺伝子は含まれない。カテゴリー 3、ウイルス特異的遺伝子は上流または下流にありますが、ウイルスの特徴的な遺伝子はありません。カテゴリー 4、ウイルスコンティグの端に位置します。キトサナーゼ AMG に対する高い信頼スコア (カテゴリー 0 ～ 2) を持つウイルスコンティグのみが、その後の分析のために保持されました (補足表 1)。

キトサナーゼ AMG を含むウイルスコンティグは、スコア付けされたタンパク質共有マトリックスに基づいてウイルス RefSeq ゲノム (v201) でクラスター化されました。ペアごとの相互作用を含むクラスタリングネットワークは、デフォルトパラメーター (v2.0.9.10) を使用して vConTACT を適用することによって生成されました。土壌ウイルスコンティグは、以前に寄託された参照ウイルスと、確実な分類学的割り当てを可能にするのに十分な遺伝子を共有していませんでした。

キトサナーゼ AMG を保有するウイルスコンティグの推定宿主は、3 つの公開されているバイオインフォマティクスツールを使用して予測されました: 1) WIH57 (v1.0、ベストヒット)、2) VirHostMatcher58 (v1.0.0、ベストヒット)、および 3) 原核生物ウイルスホスト予測子 (PHP)59 (「コンセンサス」)。ウイルスコンティグの最終的な宿主分類は、3 つのツールのうち少なくとも 2 つのツールの結果がコンセンサスに達したときに割り当てられました。

検出されたウイルスキトサナーゼと他の分類群の GH75 キトサナーゼの系統学的関連性を描写するために、古細菌、細菌、真菌およびウイルスのキトサナーゼのタンパク質配列の多重配列アラインメントに基づいて系統樹を構築しました。この木は、バクテリオファージリゾチーム (YP_006987285.1) を使用して再根付けされました。生命のすべてのドメインにわたる多様な遺伝空間をカバーするために、私たちはまず NCBI タンパク質データベース (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein、2021 年 10 月 11 日にアクセス) から「キトサナーゼ」をクエリしました。 GH75 キトサナーゼ pfam (PF07335) によってスクリーニングされます。活性部位の重要な残基を同定するために使用される細菌および真菌の GH75 キトサナーゼの配列も参考文献の一部として含まれています。次に、CD-HIT (v4.8.1)60 を使用して冗長性を除去するために参照配列を 70% のアミノ酸同一性でクラスター化し、150 アミノ酸を超える長さの各クラスターの代表的な配列を最終的な参照セットに含めました。、その結果、古細菌からの 2 つの配列、細菌からの 230 配列、真菌からの 180 配列が得られます。複製を解除されたウイルスキトサナーゼと参照配列は、MAFFT をデフォルトパラメータ (v7) で使用してアラインメントされました61。複数の配列アラインメント (MSA) を手動で検査し、ウイルス配列と参照配列にわたる予測活性部位の 4 つの重要な残基の位置に基づいて調整しました。アラインメントの領域は、最初の保存残基 (予測活性部位) から最後の保存残基までです。さらに、配列の 10% 未満にギャップがある場合でも、よく整列した隣接する残基を保持しました (補足データ 1)。系統樹は、モデル指定 LG+ G8+ F および 500 ブートストラップ 62 を備えた RAxML (v1.0.1) を使用して構築されました。

推定上の土壌ウイルスキトサナーゼ配列（Ga0126380_1000012531：図1では二重アスタリスクで示されている）をコードする遺伝子を化学合成し（Twist Bioscience、カリフォルニア州サンフランシスコ）、20残基の延長部分を含むpET28aのNdeI部位に挿入した。 N 末端 (MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH) には、発現タンパク質の一次アミノ酸配列にポリヒスチジン金属アフィニティータグ (太字) とトロンビンプロテアーゼ切断部位 (下線) が含まれています。組換えプラスミドを使用して、化学的にコンピテントな大腸菌 BL21(DE3) (Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド) を形質転換し、シングルコロニーから約 1 mL ～ 15% グリセロールストック (LB 培地、OD600nm = ～ 0.8) を調製し、凍結しました ( −80 °C）は将来の使用に備えてあります。このグリセロールストックを使用して 25 mL の LB 培地を播種し、OD600nm が約 0.8 になるまで増殖させた後、750 mL の自己誘導 LB 培地 63 (2 L フラスコ、200 rpm シェーカー、0.34 ug/uL カナマイシン、37 °C) に移しました。。 OD600nm が約 1 に達したら、温度を 30 °C に下げました。約16時間後(翌日)に穏やかな遠心分離により細胞を回収し、凍結(-80℃)した。凍結ペレットを解凍し、フレンチプレス（SLM Aminco、ニューヨーク州ロチェスター）に3回通す前後に超音波処理（約1分間）することによって細胞を溶解した。遠心分離後、可溶性画分中のタンパク質を従来の 2 段階の精製プロトコールを使用して精製しました。20 mL Ni-Agarose 6 FastFlow カラム (GE Healthcare、ニュージャージー州ピスカタウェイ) での金属キレートアフィニティークロマトグラフィーと、それに続くゲル濾過クロマトグラフィーです。 Superdex HiLoad 26/60 カラム (GE Healthcare、ニュージャージー州ピスカタウェイ)64. 最後のカラムステップ後の標的タンパク質を含む画分を 2 ～ 5 mg/mL に濃縮し (タンパク質緩衝液: 100 mM NaCl、20 mM Tris、1 mM DTT、pH 7)、結晶化または酵素に使用するまで 4 °C で保存しました。アッセイ。 LB 培地 1 リットルあたり 2 ～ 4 mg の精製タンパク質の収量が得られました。同じプロトコルを適用して、それぞれ点置換 D148N または E157Q を含む 2 つの修飾タンパク質を調製しました。突然変異誘発は次のように実施した65: 簡単に言うと、野生型遺伝子を含む鋳型プラスミドの最初の鎖にNt.BbvCIでニックを入れ、エキソヌクレアーゼIおよびIIIで消化した。オリゴヌクレオチド (Thermo Fisher, Pleasanton, CA) は、所望の位置に点突然変異を導入するように設計され、一本鎖鋳型 DNA と 1:20 の比率で追加されました。プライミング配列は Phusion ポリメラーゼで伸長されました。 Taq DNA リガーゼでニックを解決した後、2 番目の野生型鎖に Nb.BbvCI でニックを入れ、エキソヌクレアーゼ I で消化し、2 番目のオリゴヌクレオチドからプライミングすることによって再生して、完全な変異誘発 dsDNA 分子を作成しました。すべての酵素は、マサチューセッツ州イプスウィッチの NEB から入手しました。組み立てられた構築物の配列を検証した（Pacific Biosciences Sequel IIe、PacBio、カリフォルニア州メンローパーク）。

野生型 V-Csn と 2 つの修飾タンパク質は、アズリン架橋 (AZCL) キトサン基質 (AZCL-キトサン; Megazyme、アイルランド、ウィックロー) を使用してエンドキトサナーゼ活性についてテストされました 66。各タンパク質の原液 (1200 μg/mL) を、40 mM 酢酸ナトリウム、100 mM NaCl、1 mM DTT 中の pH 4.3、5.1、および 6.5 の AZCL-キトサン懸濁液 (2500 μg/mL) とともにタンパク質緩衝液で調製しました。反応は、５００μＬエッペンドルフチューブ中の１００μＬのＡＺＣＬ－キトサンに１７μＬのタンパク質（２０μｇ）を添加することにより、室温で３回行った。多目的チューブローテーター（Fisher Scientific）での回転（40 rpm）によりチューブを撹拌した。活性は、簡単な遠心分離で基質をペレット化し、2 μL アリコートを使用して放出されたアズリン結合生成物の 590 nm での吸光度 (NanoDrop 2000c; Thermo Scientific) を測定することによってモニタリングしました。ブランク反応では、タンパク質の非存在下ではアズリン結合生成物の放出は示されず、反応前後の pH 測定値の変化は 0.1 pH 単位未満でした。

V-Csn の初期結晶化条件は、Top96 スクリーン (Anatrace) を使用するハンギングドロップ法を使用して得られました。結晶は複数の条件で観察されました。いくつかの条件からの結晶を収集し、20% エチレングリコールを添加したそれぞれの結晶化条件で液体窒素中で瞬間冷却しました。結晶はビームライン BL9-2 での回折スクリーニングのために SSRL に送られました。 3 つの条件により、高解像度で回折する結晶が得られました。条件 #45 (0.2 M 硫酸アンモニウム、0.1 M 酢酸ナトリウム pH 4.6、30% MMePEG2000)、空間群 C2、単位胞寸法 a = 108.84 Å、b = 47.63 Å、c = 45.55 Å、β = 97.8°、非対称ユニット (AU) 内のモノマー。条件＃３８（０．１Ｍクエン酸塩、ｐＨ５．５、２０％ＰＥＧ３０００）、空間群Ｃ２、ユニットセル寸法ａ＝１６３．３０Å、ｂ＝４６．００Å、ｃ＝７３．５６Å、β＝９２．３°、ＡＵ内に２つのモノマー；および条件 #20 (0.2 M 硫酸アンモニウム、0.1 M ビス-トリス pH 5.5、25% PEG3350)、空間群 C2、単位セル寸法 a = 80.47 Å、b = 35.76 Å、c = 80.66 Å、β = 118.5°、 AU 内に 1 つのモノマーを含む。

データセットは、条件 #45 および #38 の単結晶から収集されました。条件 #45 結晶 (apo1 と指定) では、17000 eV (0.72929 Å) の X 線とシャッターレスモードで動作する Pilatus 6 M PAD 検出器を使用して、BL12-2 で 0.2° 画像 1800 枚が収集されました。画像は XDS (v. 2021 年 2 月 5 日)67 で処理され、AIMLESS68 を使用してスケーリングされました。最終的なデータセットは、解像度 0.89 Å の 174574 個の固有の反射で構成されていました。条件 #38 結晶 (apo2) では、12658 eV (0.97946 Å) の X 線とシャッターレスモードで動作する Pilatus 6 M PAD 検出器を使用して、BL9-2 で 0.2° 画像 1800 枚が収集されました。画像は XDS67 で処理され、AIMLESS68 を使用してスケーリングされ、最終的なデータセットは 1.35 Å の解像度の 117982 個の固有の反射で構成されました。両方の結晶形に関する追加のデータ収集と処理統計を表 1 に示します。

実験段階では、飽和溶液が得られるまで（顕微鏡下で視覚的に測定）、固体のKBrを25%グリセロールを加えた条件#45結晶化緩衝液に溶解することによってKBr浸漬溶液を調製した。この溶液を新しい緩衝液で希釈して、1/8飽和結晶浸漬溶液を形成した。いくつかのapo1結晶をこの溶液中で素早く振り、液体窒素中で瞬間冷却した。回折データセットは、ビームライン BL12-2 の臭化物エッジ (13,481 eV、0.91967 Å) で KBr に浸した apo1 結晶から収集されました。逆ビーム法と 20° ウェッジを使用し、回転角 0.2°/画像で合計 3600 枚の画像を収集しました。画像は XDS67 で処理され、AIMLESS (v0.7.7)68 を使用してスケーリングされました。追加の統計を表 1 に示します。データの最初の分析では、約 1.7 Å の分解能に及ぶ臭化物からの強い異常信号が示されました。

V-Csn 構造は、PHENIX22 に実装された Br-SAD (臭化物単一異常回折) 法によって解析されました。溶媒の平坦化と密度の変更後、全体的な性能指数 (FOM) は 16 個の臭化物部位で 0.363 でした。 PHENIX (v1.20.1-4487) でのオートビルディングにより、予想される 224 個の残基のうち 221 個を含むモデルが生成されました。 phenix.refine24 による最初の改良により、Rwork と Rfree はそれぞれ 0.158 と 0.187 になりました。モデルは COOT23 を使用して完成し、apo1 データを使用して phenix.refine で 0.89 Å の分解能までさらに洗練されました。構造的および化学的に関連する位置に水分子が追加され、構造内のすべての原子の原子変位パラメータが等方的に精密化されました。 apo2 構造は、CCP4 スイート 70 のプログラム MOLREP (v11.9.02)69 を使用し、洗練された apo1 構造を検索モデルとして使用して、分子置換によって解決されました。 2 つの apo-V-Csn 構造の最終精製統計を表 2 に示します。

V-Csn 変異体 D148N および E157Q を条件 #20、#38、および #45 を使用して結晶化についてスクリーニングし、3 つすべてで結晶が観察されました。回折データセットは、条件 #45 の単一の D148N および E157Q 結晶から収集されました。 D148N 結晶の場合、BL12-2 で 1800 枚の画像 (0.2° 回転/画像) が収集され、データは XDS67 と AIMLESS68 で処理およびスケーリングされました。 E157Q クリスタルの場合、BL12-2 で 1,850 枚の画像が収集され、データは XDS67 と AIMLESS68 で処理およびスケーリングされました。データ収集統計を表 3 に示します。両方の構造は、すべての水分子を除去した精製された野生型 V-Csn 構造を出発モデルとして使用し、MOLREP69 で分子置換することによって解析されました。 D148N および E157Q 構造は phenix.refine24 で洗練されており、最終的な統計も表 3 に示されています。

Ｅ１５７Ｑ－基質複合体は、０．０６ｍｇのキトヘキサオース（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）を１０μＬのＥ１５７Ｑに３．３ｍｇ／ｍｌで溶解することによって調製し、約５ｍＭの最終キトヘキサオース濃度を得た。結晶化条件#45に対してシッティングドロップを設定する前に、複合体を4℃で1時間インキュベートしました。設定後数時間で結晶化液滴にストリークシードを行い、一晩すべての液滴で複合体の結晶が観察されました。結晶は、同じ条件下で成長させた野生型および変異型結晶と形態学的に類似していた。結晶を２５％グリセロールを加えた結晶化緩衝液に移し、液体窒素中で瞬間冷却した。回折データは BL12-2 で収集されました。合計 1,800 枚の画像が収集され、データは XDS67 と AIMLESS68 で処理およびスケーリングされました。 E157Q-基質複合体構造は、すべての水分子が除去された精製された野生型 V-Csn 構造を開始モデルとして使用し、phenix.refine24 で精製された MOLREP69 による分子置換によって解析されました。データ収集と詳細化の統計を表 3 に示します。

AlphaFold 構造予測は、公式 GitHub リポジトリ (https://github.com/deepmind/alphafold) から取得したソフトウェアのローカルにインストールされたバージョン、または Google 共同作業の AlphaFold ノートブック (https://colab.research. google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb)。溶媒にアクセス可能な表面は、PyMOL (v2.5.2) (Schrodinger) および ICM-Pro (v3.8-6a) (Molsoft) を使用し、プローブ半径 1.4 Å (単一水分子の半径に相当) を使用して計算されました。静電表面は、PyMOL (v2.5.2) の Adaptive Poisson-Boltzmann Solver (APBS) プラグインを使用して生成されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて対応著者から入手できます。図1に使用されたウイルス配列データは、JGIウェブサイト[https://img.jgi.doe.gov/cgi-bin/vr/main.cgi]で公開されており、JGIデータポリシーに従って使用制限はありません。タンパク質構造の原子座標と構造因子は、アクセッションコード 7TVL (V-Csn apo1)、7TVM (V-Csn apo2)、7TVN (V-Csn-D148N) で RSCB Protein Data Bank (PDB) に提出されています。 7TVO (V-Csn-E157Q)、および 7TVP (V-Csn-E157Q キトヘキサオース複合体)。図 2a、c の基礎となるソースデータは、ソースデータファイルとして提供されます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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この研究は、エネルギー省 (DOE) 生物環境研究局 (BER) の支援を受けており、科学重点領域「環境摂動に対する土壌マイクロバイオームの表現型応答」の JKJ および KSH への貢献です。この研究の一部は、JEM への FICUS プログラムに基づくプロジェクト賞 (https://doi.org/10.46936/cpcy.proj.2021.60161/60000437) で実施され、DOE 共同ゲノム研究所 (JGI) およびDOE科学局のユーザー施設である環境分子科学研究所（EMSL）。両施設は生物環境研究プログラムによって後援されており、契約番号 DE-AC02-05CH11231 (JGI) および DE-AC05-76RL01830 (EMSL) に基づいて運営されています。結晶構造は、スタンフォードシンクロトロン放射光源 (SSRL) で決定されました。 SSRL は、契約番号 DE-AC02-76SF00515 に基づいて米国エネルギー省基礎エネルギー科学局に代わってスタンフォード大学が運営する国立ユーザー施設です。 SSRL 構造分子生物学プログラムは、エネルギー省、生物環境研究局、および国立衛生研究所 (NIGMS) の助成金番号 P30GM133894 によって支援されています。酵素機能の予備的な結果は、ブリティッシュコロンビア大学の Gregor Tegl と Stephen Withers によって提供されました。

これらの著者は同様に貢献しました: Ruonan Wu、Clyde A. Smith。

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スタンフォードシンクロトロン放射線光源、スタンフォード大学、メンローパーク、カリフォルニア州、米国

クライド・A・スミス

ワシントン州立大学分子生物科学部、プルマン、ワシントン州、米国

ギャリー・W・ブチコ

米国エネルギー省共同ゲノム研究所、ローレンス・バークレー国立研究所、米国カリフォルニア州バークレー

イアン・K・ブレイビー、ニコス・C・キルピデス、吉国康夫

マンモスバイオサイエンス、ブリスベン、カリフォルニア州、米国

デビッド・パエス・エスピノ

オレゴン健康科学大学、分子微生物学および免疫学部、米国オレゴン州ポートランド

ジェイソン・E・マクダーモット

ワシントン州立大学生物化学研究所、プルマン、ワシントン州、米国

ジョン・R・コート

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

RW はバイオインフォマティクス分析の大部分を実行しました。 CAS はキトサナーゼ酵素の結晶構造を決定し、その機構を解明しました。 GWB はキトサナーゼタンパク質を発現し、結晶化条件をスクリーニングし、活性アッセイを実施しました。 IKB と YY は、キトサナーゼ遺伝子と変異体の合成とクローニングを実施しました。 NCK は、公的に入手可能なキトサナーゼ配列のデータベース検索と DOI を提供しました。 DP-E.、JRC、および CAS は、タンパク質構造の AlphaFold 予測を実行しました。 KSH、JKJ、JEM、CAS が研究に資金を提供しました。 JKJがこの研究をコーディネートした。著者全員が原稿の執筆に協力しました。

ジャネット・K・ヤンソンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読への貢献について、Rey-Ting Guo 氏と Ella Sieradzki 氏に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

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転載と許可

Wu、R.、Smith、CA、Buchko、GW 他。土壌ウイルスの補助代謝遺伝子産物である機能的キトサナーゼの構造特性評価。 Nat Commun 13、5485 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32993-8

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受領日: 2022 年 3 月 30 日

受理日: 2022 年 8 月 26 日

公開日: 2022 年 9 月 19 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32993-8

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